游离脂肪酸（Free fatty acids, FFA）是脂质代谢的关键中间体，在许多关键的生物学过程中都起着至关重要的作用。FFAs水平的变化与多种慢性疾病包括糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝和癌症的发生发展有关。FFA中碳-碳双键（C=C）的特定位置通常与独特的生物学功能有关。多项研究表明，癌细胞或组织中FFA的双键位置异构体的水平发生了变化。因此，研究者们越来越关注FFA成分（包括其结构信息，如双键位置）在代谢紊乱中的作用。质谱（MS）是最常用的脂质组学技术。由于具有快速的数据采集和复杂脂质的鉴别能力，基于电喷雾电离-质谱（ESI-MS）的鸟枪质谱法（shotgun-MS）越来越多地用于FFA分析。在这种方法中，提取物通过直接进样分析，而无需色谱分离。尽管shotgun-MS具有强大的功能，但对复杂生物基质中的FFA进行分析时，仍有两个问题需要解决：（1）精准的结构组成分析，尤其是FFA的C = C位置；（2）负离子模式下FFA较低的电离效率和较低的检测灵敏度。

近年来，臭氧分解（OzESI或OzID）、环氧化、电子诱导解离（EID）以及离子淌度等技术均被用来分离脂质双键位置异构体，但是都需要特定的设备或需要对质谱仪器进行改造。最近，有研究报道了采用丙酮为衍生试剂，通过Paterno−Buchi（PB）反应将C=C键转化为易于碎裂的四元环的策略。PB反应与串联MS结合，能够根据成对的诊断离子对各种脂质分子的C=C位置异构体进行精确的鉴定和定量。该方法的显著优点包括衍生试剂成本低且容易获取、实验装置简便以及谱图易于解释。但是，该方法对于高不饱和度的脂肪酸，几乎不产生诊断离子；并且由于FFA的离子化效率低，检测灵敏度不高。因此，尽管分析技术发展迅速，但对复杂生物基质中具有三个以上双键的FFA中C=C位置的鉴定仍然是一个挑战。

中国农业科学院油料作物研究所产品加工与营养创新团队的魏芳研究员提出了一种基于双衍生化策略的痕量游离脂肪酸双键位置的高覆盖、高准确度和高灵敏度的鸟枪质谱分析方法。采用双衍生策略，将FFA中C=C键的丙酮标记与FFA中羧基的N,N-二乙基-1,2-乙二胺（DEEA）标记相结合，实现了对FFA的C=C键（1-6个双键）位置的高覆盖，高准确度和高灵敏度测定。通过光化学反应对C=C键进行丙酮标记可提供特定于C=C位置的诊断离子；通过在FFA羧基端上引入易于质子化的叔胺基，可显著增强诊断离子的质谱响应。由于双衍生FFA的碰撞活化产生了丰富的C=C诊断离子以及消除二乙胺中性片段（73 Da）的产物离子，因此可以以高灵敏度和特异性实现结构表征和定量分析。利用这种双重衍生化策略，实现了对多不饱和游离FFAs的双键位置的高灵敏分析（定量限（LOQ）0.1-1.5 nmol / L）。所建立的方法成功应用于患有非酒精性脂肪肝和正常对照小鼠肝脏组织中的FFAs分析，证明了该方法的适用性。本研究开发的高特异性和高灵敏度方法有望用于生物样品中多种FFA的精确结构解析和定量，为有关FFA代谢的生物学过程的深入研究提供新的分析手段。该分析方法还有望进一步扩展到其它复杂的脂质（例如磷脂），以及应用于其他基质的样品（如食品）中脂质结构的精确剖析研究。

图1. 生物样本中FFA双衍生反应结合质谱分析流程图

图2. a. C18:1（9Z）和C18;1（11Z）摩尔比为1:1混合后双衍生产物的串联质谱图; b. C18:3（9Z，12Z，15Z）和C18:3（6Z，9Z，12Z）摩尔比为1:1混合后双衍生产物的串联质谱图。

图3. 非酒精性脂肪肝及正常小鼠肝脏中C16:0 (a), C18:1(Δ9) (b), C18:2(Δ9, 12) (c), C20:4(Δ5, 8, 11, 14) (d)的含量，每个点代表每个样本的含量，线条代表小鼠肝脏样本中FFA的平均含量；（e）非酒精性脂肪肝及正常小鼠肝脏中FFA C18:1(Δ9) vs C18:1(Δ11) 的比例以及 C18:3(Δ9,12,15) vs C18:3(Δ6,9,12)的比例；（f）非酒精性脂肪肝及正常小鼠肝脏中FFAs的偏正交最小二乘判别分析(Orthopls-DA)。

该研究成果近期发表于国际期刊Analytical Chemistry（IF 6.35）。中国农业科学院油料作物研究所魏芳研究员为论文的通讯作者，博士生徐淑玲为论文第一作者。上述研究得到了国家自然科学基金（31571926）、湖北省技术创新项目（2018AHB014）、武汉市科技计划项目（2019020701011468）、中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-2013-OCRI）、中国农业科学院“青年英才计划”培育工程计划等项目的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Double Derivatization Strategy for High-Sensitivity and High-Coverage Localization of Double Bonds in Free Fatty Acids by Mass Spectrometry

Shu-ling Xu, Bang-fu Wu, Matej Orešič, Ya Xie, Ping Yao, Zong-yuan Wu, Xin Lv, Hong Chen, Fang Wei*

Anal. Chem., 2020, 92, 6446–6455, DOI: 10.1021/acs.analchem.9b05588

魏芳博士简介

魏芳，研究员。2007年获武汉大学分析化学专业博士学位。2007年7月进入中国农业科学院油料作物研究所工作。主要从事脂质组分析方法及应用研究，在基于质谱技术的复杂生物脂质的高通量分析方法及其应用研究上取得了重要进展，实现了生物样品中痕量脂质组分的高灵敏定性和定量分析，为油料脂质代谢/品质与营养研究提供了高效分析手段和全面深入的数据。主持国家、省部级竞争性科研项目10余项（其中国家自然科学基金项目3项），参加完成了国家自然科学基金重大研究计划、国家科技支撑计划、国家863计划等多项重大项目资助的课题研究。在国内外重要期刊上发表研究论文86篇，其中SCI收录56篇（单篇最高影响因子8.5），H指数21。获国家发明专利授权9项。以第一完成人获得2018年中国农科院青年科技创新奖，以第三完成人获得2018年湖北省技术发明一等奖。2012年入选湖北省新世纪高层次人才工程第二层次人选，2019年入选中国农科院“青年英才计划”培育工程院级人选。