DNA纳米机器是人工设计的DNA自组装纳米结构，利用DNA级联反应将生物刺激转换为连续的机械运动，是生物传感与成像中常用的信号放大策略。虽然DNA纳米机器在活细胞生物标志物高灵敏成像中表现出良好的性能，但是其进一步应用仍然面临以下挑战：（1）大多数DNA纳米机器对目标待测物自发响应运行，这使其在递运过程中容易被细胞外的生物标志物激活，造成假阳性信号；（2）由于不同细胞对纳米机器的摄取能力不同，其“绝对强度依赖”型的单通道荧光信号采集模式会影响检测准确性。如何实现活细胞内DNA纳米机器的可控激活是实现活细胞miRNA精准成像的关键。

针对这一问题，近日南京大学生命分析化学国家重点实验室刘颖教授（点击查看介绍）课题组利用多波长发射的上转换发光纳米材料（UCNPs），设计了一种“光拉链”封闭的内参比型DNA纳米机器（PZ-DNA nanomachine），实现了活细胞内DNA纳米机器的可控激活与miRNA的精准成像。如图1a所示，光拉链封闭的DNAzyme链（P-DNA walker）和末端修饰BHQ2的底物链（S-DNA-BHQ2）共同连接在UCNPs的表面。P-DNA walker的活性被光拉链（photo zipper）有效抑制。光拉链包括三个部分：封闭DNAzyme锚定臂的区域（c）、miRNA识别区域（a*+b）、以及和miRNA识别区部分杂化的miRNA封闭区域（a+h）。a*和h之间嵌合一个可被UV光切的pc-linker，在不进行光照时，光拉链有效封闭了miRNA的识别区域从而能够有效地保护纳米机器在递运过程免受细胞外靶标的激活。

如图1b所示，当DNA纳米机器被细胞摄取之后，被5分钟的短暂UV光照射激活，DNAzyme随之响应细胞内的miRNA对底物链S-DNA-BHQ2进行酶切，切割后由于结合碱基数不足，DNAzyme walker就可以被释放，进而和下一个底物链进行连续反应。通过DNA纳米机器的连续运动，标记BHQ2的底物链片断源源不断地被切割下来。当完成DNAzyme酶切反应后，近红外光激发下UCNPs上修饰的Cy3染料580 nm处的发射光恢复，实现了miRNA响应型活细胞内高灵敏成像。而UCNPs在近红外光激发下658 nm发射峰在DNA纳米机器运行过程中保持不变，可以作为内参比进行活细胞内成像自校准，从而提高成像准确性。

图1. 光拉链封闭的DNA纳米机器制备(a)，活细胞内激活与miRNA响应(b)

这一研究通过设计“光拉链”有效保护了DNA纳米机器在细胞递运过程中的非特异性激活，免除了“假阳性”信号的产生。同时利用UCNPs的多重发光为活细胞内成像提供内参比以增强检测的准确性。该研究所提出的可控激活型DNA纳米机器对MCF-7、MDA-MB-231、HEK-293等不同细胞系中miNA的成像都展现出很高的灵敏度与准确性，根据成像结果测得的miRNA含量与细胞裂解液中miRNA含量趋势相一致（图2），为活细胞内可控高效的生物标志物的精准成像提供了一个通用的平台。

图2. 不同细胞系中miRNA 21表达水平的定量分析：(a)细胞共聚焦成像 (scale bar: 30 μm)，(b)共聚焦成像归一化Cy3荧光强度恢复(I₅₈₀/U₆₅₈)及不同细胞中miRNA 21的qRT-PCR定量

相关成果近期发表在Chemical Science。南京大学硕士研究生张越为文章的第一作者，刘颖教授为文章的通讯作者。研究课题得到了鞠熀先教授的大力支持，该工作得到了国家自然科学基金、江苏省特聘教授、江苏省双创人才等项目的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Photo zipper locked DNA nanomachine with internal standard for precise miRNA imaging in living cells

Yue Zhang, Yue Zhang, Xiaobo Zhang, Yu-yi Li, Yuling He, Ying Liu, Huangxian Ju

Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/D0SC00394H

导师介绍

刘颖

https://www.x-mol.com/university/faculty/22031